王艷輝1,2，王伽伯2*，覃魯珊2，郝慶秀3，張雅銘2，趙艷玲2，格小光3，郭蘭萍3，黃璐琦3，肖小河2

(1. 湖南中醫(yī)藥大學，湖南 410007;2. 解放軍302醫(yī)院全軍中藥研究所，北京 100039;

3. 中國中醫(yī)科學院中藥資源中心，北京 100700)

[摘要] 目的：從化學和生物兩方面綜合考察不同產地穿心蓮藥材品質差異。 方法：采用微量量熱法比較13批不同產地穿心蓮藥材的抗痢疾桿菌生物活性。同時建立穿心蓮的UPLC指紋圖譜，采用偏最小二乘法(PLS)回歸分析抑菌活性與化學成分之間的相關性。結果：13批不同產地的穿心蓮藥材使痢疾桿菌生長代謝的時間延長，生長速率常數減小，表明不同產地穿心蓮對痢疾桿菌的生長代謝均有不同程度的抑制作用，且以西雙版納產地的穿心蓮藥材抑菌效果最好。此外，通過偏最小二乘法回歸分析找到了四個與抑菌活性密切相關的化學成分。結論：不同產地穿心蓮藥材質量差異較大，云南、海南、廣西和四川綜合質量較好。生物活性測定結合化學指紋圖譜評價藥材質量的方法，可準確、可靠地評價不同產地穿心蓮藥材的質量，為其質量控制提供依據。

[關鍵詞]穿心蓮;質量評價;微量量熱法;痢疾桿菌;化學指紋圖譜;

Evaluation of the chemical contents , fingerprint and antimicrobial activity of Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees harvested in different regions

WANG Yan-hui1,2, WANG Jia-bo2*, QIN Lu-shan2, HAO Qing-xiu3, ZHANG Ya-ming2, ZHAO Yan-ling2, GE Xiao-guang3, GUO Lan-ping3, HUANG Lu-qi3, XIAO Xiao-he2

(1. Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Hunan 410007, China; 2. China Military Institute of Chinese Materia Medica, 302 Military Hospital, Beijing 100039, China; 3. National Resource Center for Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences Beijing 100700, China )

[Abstract] Objective: The aim of the study was to evaluate the quality of Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees harvested in different regions of China. Method: The inhibitory effects of A. paniculata on Shigella dysenteriae growth were investigated by microcalorimetry. UPLC fingerprints of the A. paniculata samples were acquired and then analyzed the correlation with the antimicrobial activity by partial least squares (PLS) analysis. Result: Compared with the control group, all A. paniculata samples from different regions showed inhibitory effects to S. dysenteriae with extending of growth time and decrease of metabolism. And the samples from Yunnan Xishuangbanna had stronger antimicrobial effects than others. According to PLS analysis, there were four chemical contents correlative to the activity of antimicrobial effect. Conclusion: The harvest region had significant influence to the quality of A. paniculata and Yunnan, Hainan,Sichuang and Guangxi were the good harvest regions. The combined evaluation of biological activity and chemical fingerprint provides ability to integrally evaluate the quality of A. paniculata.

[Key words] Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees; quality evaluation; microcalorimetry; Shigella dysenteriae; chemical fingerprint;

穿心蓮為爵床科一年生草本植物穿心蓮 Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees 的干燥地上部分，原產于印度、斯里蘭卡、巴基斯坦、泰國、越南等國，我國于20世紀50年代引種栽培，主要分布于廣東、廣西、海南、云南等地[1]。穿心蓮是臨床治療呼吸道感染、急性菌痢、腸胃炎及感冒發(fā)熱等疾病的常用中藥，然而該藥在我國引種60余年來，其資源分布和種植情況尚缺少系統(tǒng)研究。為此，在第四次全國中藥資源普查中[2-4]，將穿心蓮作為重要品種調查研究，以期了解該藥的藥材質量情況，明確該藥的生長適宜環(huán)境，為更好地發(fā)展和利用該藥提供基礎數據。

穿心蓮主要功效為清熱解毒、涼血、消腫，臨床上多用于感染性疾病的治療。穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯是穿心蓮的主要活性成分和質量控制指標[5]。為此，本文采用生物活性評價方法[6-8]檢測不同產地采集穿心蓮的抑菌活性差異，測定指標成分含量和化學指紋圖譜，綜合評價不同產地采集穿心蓮藥材的品質，探討優(yōu)質藥材適宜產地;結合“譜-效”[9-10]相關研究初步探討穿心蓮抑菌活性的主要藥效物質，為后續(xù)穿心蓮品質評價提供參考依據。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

Waters Acquity UPLC 型超高效液相色譜儀 (美國Waters公司)，色譜柱(Waters BEH C18，100 mm×2.1 mm，1.7 μm);Mettler Toledo AL204微量分析天平，Thermometric 3114 TAM Air Isothermal Calorimeter微量量熱儀(Thermometric AB，Sweden);THZ—22臺式恒溫振蕩器;SW-CJ-2F 型雙人單面凈化工作臺。Milli-Q 超純水處理系統(tǒng) (Millipore，Bedford，美國)。

1.2 實驗材料

菌株：痢疾桿菌(Shigella dysenteriae，CMCC B 51252)，由中國藥品和生物制品檢定所提供。培養(yǎng)基：Luria broth (LB)液體培養(yǎng)基，取 5 g NaC1、5 g酵母膏、10 g 蛋白胨，溶解于1000 mL 去離子水中，調 pH 7.0～7.2 后分裝，121 ℃高壓蒸氣滅菌 30 min, 冷卻后置 4 ℃冰箱，備用。

甲醇、乙腈為色譜純(美國 Fisher 公司)，其它試劑均為分析純;水為去離子水。穿心蓮內酯對照品(批號110797-201108 )購自于中國藥品生物制品鑒定所，脫水穿心蓮內酯對照品(批號134418-28-3)購自于成都曼斯特生物科技有限公司，穿心蓮藥材由中國中醫(yī)科學院中藥研究所郝慶秀副研究員采集，經中國人民解放軍第三O二醫(yī)院全軍中醫(yī)藥研究所肖小河研究員鑒定均為爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata (Burm. f.) Nees 的全草或葉，具體見表1。

表1 收集的穿心蓮藥材及其內酯的成分含量

2. 實驗方法

2.1 抑菌活性測定方法

藥材制備 稱取不同產地穿心蓮藥材粗粉適量，10倍量去離子水浸泡30min，回流提取2次(10倍量水2h，8倍量水1.5小時)，合并提取液，濃縮，真空減壓干燥得干浸膏備用。分別取不同產地穿心蓮干浸膏適量，以LB培養(yǎng)基為溶劑，配制成藥液(相當于生藥量25mg)，0.22微孔濾膜過濾除菌。

在無菌條件下，精密加入5mL接種了痢疾桿菌的LB培養(yǎng)基至20ml玻璃瓶中，接種量為2×106 (CFU)/mL。再加入5mL用LB培養(yǎng)基配制的各樣品的藥液，加蓋瓶塞，密封，放入微量量熱儀中，跟蹤記錄痢疾桿菌生長代謝的熱譜曲線。控溫于37℃，當曲線再次回歸到基線時，結束實驗。

2.2 穿心蓮指紋圖譜建立

色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18分析柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫為25 ℃。

流動相組成：流動相 A：乙腈，流動相 B：0.05%磷酸-水，線性梯度洗脫程序：0 min，10%A; 4 min，17%A;7 min，27%A;14 min，32%A;18 min，80%A。流速0.3 mL/min，檢測波長250 nm，進樣量5 μL。

對照品溶液的配制 精密稱取穿心蓮內酯、脫水穿心蓮內酯標準對照品適量，分別置于10mL容量瓶中，加50%甲醇10mL超聲溶解，放冷，補加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm濾膜過濾即得標準品溶液。

供試品溶液的配制 取13批不同產地穿心蓮樣品干浸膏適量，精密稱定，分別置于10ml容量瓶中，加50%甲醇10mL，超聲溶解，放冷，補加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，配制成10 mg/mL(以生藥量計)的供試品溶液。

UPLC指紋圖譜的建立 分別取穿心蓮供試品溶液、標準品溶液5μL，注入超高效液相色譜儀，記錄18min內色譜圖。

2.3 相關分析 采用SIMCA-P+12.0.1統(tǒng)計軟件進行偏最小二乘法(PLS)回歸分析，通過比較各色譜峰的標準化回歸系數的大小與正負分析指紋圖譜色譜峰與抑制率的相互關系，VIP>1為有統(tǒng)計學意義[11]。

3 結果

3.1 生物熱活性檢測結果

3.1.1痢疾桿菌的生長代謝熱譜曲線

圖2是在恒溫37℃條件下，痢疾桿菌在空白培養(yǎng)基中的生長代謝的熱譜曲線。根據熱譜曲線，痢疾桿菌的生長代謝過程可分為4個時期:第一指數生長期(A-B)、停滯期 (B-C) 、第二指數生長期(C-D)和衰亡期(D-E)[12-13]。通過熱譜曲線，我們得到一個關于指數增長期的lnPt 與t的線性方程、第一、二指數生長速率常數k1、k2，最大發(fā)熱功率P1、P2，達峰時間t1、t2及總的產熱量Q[14-15]。

Pt = P0 exp(kt) 或 lnPt = lnP0 + kt (1)

方程(1)中，P0、Pt分別是細菌在指數生長的起始點和t時的熱功率。將圖譜的兩個指數生長期P、t值代入公式進行線性擬合，可得到痢疾桿菌的第一、第二指數生長期生長速率常數k1、k2值。

3.1.2 穿心蓮作用于痢疾桿菌的熱譜曲線

在37℃，采用安瓿法測定了痢疾桿菌生長代謝熱譜曲線以及3mg/ml不同產地穿心蓮提取物作用下的生長代謝熱譜曲線見圖2。從圖中可以看出，13批不同產地穿心蓮藥材細菌生長代謝兩個最高峰的峰高及出峰時間明顯發(fā)生了改變，并且其上升段的斜率也不同，表明細菌的生長代謝受到了影響，具體表現(xiàn)為達峰時間t的延長，生長速率常數k也降低，總產熱量Q減小。體現(xiàn)在表3，給藥組與空白組比較，在不同產地穿心蓮作用下痢疾桿菌生長代謝的k2，P2減小，t2增大，表明痢疾桿菌的生長受到抑制。

3.1.3 熱力學參數的主成分分析

不同產地的穿心蓮抑制痢疾桿菌作用的生物熱動力學特征信息可由生物熱活性參數(k1、t1、P1、k2、t2、P2和Qt)進行表征。為了判斷影響生物熱活性的主要因素，以穿心蓮對痢疾桿菌作用的生物熱活性的熱力學參數作為因子進行主成分分析，各熱動力學參數依次用X1(k1)，X2(k2)，X3(t1)，X4(P1)，X5(t2)，X6(P2)，X7(Qt)表示，以SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件進行主成分分析。

由相關矩陣的特征值可知，前兩個主成分的貢獻率分別為59.276%和20.054%，累計貢獻率為79.33%。由特征向量得到前兩個主成分的關系式：

F1=0.493X1+0.026X2-0.806X3+0.905X4-0.959X5+0.867X6+0.883X7

F2=0.592X1+0.849X2-0.017X3+0.004X4-0.191X5-0.148X6-0.407X7

系數的絕對值越大，說明該主成分受指標的影響越大，因此決定第一主成分和第二主成分大小的主要為X5和X2，即第二指數生長期的達峰時間t2和第二生長速率常數k2可較大程度的表征穿心蓮熱譜曲線的整體信息。

3.1.4 穿心蓮作用于痢疾桿菌的熱動力學參數

根據主成分分析的結果，在整個熱力學參數中t1，k2為主要的影響因子，即t2和k2在一定程度上可以表達整個生物動力學參數的信息，反應為痢疾桿菌代謝的主要指標，由于第二指數生長期的達峰時間t2貢獻率(59.276%)高于第二指數階段生長速率常數k2(20.054%)，因此本文選擇t2計算抑菌率(I%)為穿心蓮作用于痢疾桿菌生長代謝量效關系的評價指標，按公式(2)進行計算。

I%=(t2 – t0)/ t0 ×100% (2)

式中t0為未經藥物干預時痢疾桿菌生長代謝的第二指數生長期的達峰時間，t2為痢疾桿菌在不同產地穿心蓮作用下的第二指數生長期的達峰時間。

由圖2熱譜曲線和表2的熱力學參數可知，產于西雙版納地區(qū)的穿心蓮藥材作用于痢疾桿菌生長代謝過程的出峰時間延長最顯著，抑制率I最高，表明產自西雙版納的穿心蓮藥材的抑菌作用最強。產自海南，廣西，四川，安徽地區(qū)的穿心蓮藥材抑菌作用相對較差。

表2 不同產地穿心蓮作用于痢疾桿菌的熱動力學參數

3.2 穿心蓮的指紋圖譜分析

對該UPLC實驗條件進行方法學考察，結果表明儀器的精密度、穩(wěn)定性和方法的重現(xiàn)性良好，RSD均小于3.0%。

根據色譜條件，建立13批不同產地穿心蓮樣品的指紋圖譜，采用藥典委員會推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 1.0A版》軟件進行分析，確定了21個共有峰，其中13號峰為穿心蓮內酯，21號峰為脫水穿心蓮內酯。見圖1。

圖1 不同產地穿心蓮的UPLC指紋圖譜

13---穿心蓮內酯，21---脫水穿心蓮內酯

3.3 穿心蓮指紋圖譜與抑菌活性的相關性分析

采用PLS法對13批穿心蓮的抑菌作用與其對應的化學指紋圖譜進行相關分析，發(fā)現(xiàn)二者有一定的相關性。根據交叉驗證確定的PLS成分數為3時，模型對X，Y的解釋能力分別為0.869和0.831，交叉有效性Q2為0.547，說明模型具有良好的預測能力。其中2、6、11、13、15、16、17、18、20號色譜峰與抑菌活性的變化的相關性較強即這9個色譜峰的相對峰面積影響痢疾桿菌的生長代謝，其中2、6、11、15、17號色譜峰與抑菌活性的變化呈負相關，而13、16、18、20號色譜峰與抑菌活性的變化呈正相關，其標準化回歸系數分別為0.217、0.254、0.253、0.272，說明這四個色譜峰對抑菌活性的貢獻最大，可以推測，這四個色譜峰可能是穿心蓮產生抑菌活性起主要作用的色譜峰，即穿心蓮生物熱活性的不同效能主要由13號峰(穿心蓮內酯)、16、18、20號色譜峰的含量決定，其中16號峰、18號峰和20號峰均為未知峰，其具體的結構和名稱需要進一步的研究。

4 討論

本研究建立了微量量熱法結合化學指紋圖譜評價穿心蓮藥材質量的方法。生活性檢測可以反映藥物的整體作用;化學指紋圖譜能全面、綜合地反映中藥所含成分的相對關系[16-17]，二者結合可準確、可靠地評價不同產地穿心蓮藥材的質量。

微量量熱實驗結果表明，給藥組相對于空白組，痢疾桿菌生長代謝曲線的第一生長峰和第二生長峰的達峰時間t2整體呈后延趨勢，說明不同產地的穿心蓮藥材對痢疾桿菌的生長均有抑制作用。其中，產自云南、海南、四川、廣西地區(qū)的穿心蓮抑菌效果較好;而來源于安徽地區(qū)的穿心蓮抑菌效果較差。穿心蓮喜溫暖濕潤氣候，怕干旱，其最適宜溫度為25~30℃和較高的濕度[18-19]。從地理環(huán)境上看，云南，廣西、海南等地抑菌效果較好的穿心蓮藥材，其穿心蓮內酯的含量也較高。說明氣候條件及地理環(huán)境對穿心蓮藥材的質量影響較大，穿心蓮藥材適宜生長在溫暖濕潤的熱帶和亞熱帶地區(qū)。因此引種穿心蓮時，應合理選擇適宜生態(tài)環(huán)境的產地，提高穿心蓮藥材質量。

將中藥活性作用與化學成分相關聯(lián)的是研究中藥有效成分的方法之一[20-21]。偏最小二乘法(PLS)回歸允許在樣本數少于變量數的條件下進行回歸建模，因而適用于中藥指紋圖譜小樣本分析[22]。因此本研究將中藥穿心蓮化學指紋圖譜中化學成分的變化與微量量熱技術結合起來，進行了PLS回歸分析。通過回歸分析，我們發(fā)現(xiàn)了4個與抑菌活性成正相關的成分，其中之一為穿心蓮內酯，另外3個成分的結構有待進一步的確定。由其含量測定可知，其穿心蓮內酯含量較高的樣品，抑菌活性也較好。并且從其不同部位來看，全草及葉中的穿心蓮內酯含量較高，莖中的穿心蓮內酯含量較少并且其抑菌效果也較差，說明穿心蓮藥材適合全草或者葉入藥。但脫水穿心蓮內酯是否為有效成分，其含量高低是否影響到穿心蓮藥材的抑菌活性，還有待進一步研究。

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