覃魯珊1,2‡，李奇1，馬致潔1,3，趙艷玲1，張雅銘1，張萍1，鄢丹1，柏兆方1，趙奎君3，王伽伯1*，肖小河1*

解放軍302醫院·全軍中醫藥研究所;2 江西中醫藥大學;3 首都醫科大學附屬北京友誼醫院;

摘要： 目的 運用代謝組學方法對何首烏致肝損傷大鼠的尿液代謝差異進行表征，尋找潛在的生物標志物并探討何首烏致肝損傷的作用機制。方法 采用液相色譜-質譜方法測定正常組大鼠尿液與何首烏組大鼠尿液的代謝指紋譜，利用多元統計分析方法比較兩組的代謝譜差異，篩選出可能的潛在生物標志物，并作出相關代謝途徑的可能解釋。結果和結論 經比較分析，共篩選得到27個潛在生物標志物，這些重要的差異代謝物主要參與了氨基酸代謝、三羧酸循環和脂質代謝等相關通路。

關鍵詞 ：何首烏;肝損傷;代謝組學

Abstract: Differences between the characterization of urine metabolism in hepatopathy rats induced by Polygonum multifulorum was study which basing on metabonomics. In addition, searching the potential biomarkers and studying the mechanism of liver injury induced by Polygonum multifulorum. In this paper LC-MS method has carried on the analysis to metabolic fingerprint spectrum between treatment group and control group . Comparison the difference and screening the potential biomarkers which using the multivariate statistical methods. As well, metabolic pathway would be detailed description. The results show that twenty seven potential biomarkers were screened and these biomarkers involved amino acid metabolism, tricarboxylic acid cycle and lipid metabolism.

Key words: polygonum multiflorum; liver injury; metabonomics

何首烏始載于《開寶本草》， 為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb. 的干燥塊根。其味苦、甘、澀，微溫，具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁降脂等功效[1]。然而，近年來國內外關于何首烏肝毒性的報道日漸增多[2-9]：如澳大利亞、英國、荷蘭、哥倫比亞、意大利、韓國和中國香港等相繼出現何首烏肝損害的病例報道，癥狀分別表現為輕重度黃疸、急慢性肝炎、肝功能異常等。前期，課題組對何首烏進行研究，發現在特定的人群中何首烏的肝毒性確實客觀存在，進一步研究發現何首烏不止對肝臟有損傷，對腎和肺臟也有一定程度的損傷[10]，但其毒性機制尚不明確。肝功能生化指標[11]是目前檢測肝臟是否病變的主要參考指標，課題組前期研究發現谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶對何首烏肝損傷不敏感[10]，所以篩查出新的靈敏的何首烏肝損傷生物標志物對此類肝病的早期診斷與治療具有一定的參考作用。

代謝組學(metabonomics)是研究外源性物質作用于機體后所有內源性代謝產物及其中間體種類、數量及其變化規律的新興學科。代謝組學的主要研究材料有尿液、血液、各種分泌液及活檢組織(如肝穿標本)等。目前，用代謝組學的方法和技術對血、尿、肝組織進行整合分析，在藥物誘導的肝臟毒性研究中發揮著極其重要作用。

本研究采用液相色譜-質譜(LC-MS)儀器分析與數學解析相結合的代謝組學技術，考察正常大鼠尿液與何首烏致肝損傷大鼠尿液之間的代謝特征譜差異，結合代謝通路數據庫，尋找與藥物作用機制相關的代謝物和相應的代謝網絡，探討相關的藥物作用機制，為何首烏致肝損傷疾病的早期診斷和治療提供參考。

材料與方法

儀器 高效液相色譜(Agilent 1200 HPLC，美國Agilent公司)-四級桿飛行時間串聯質譜儀(Bruker microTOF-QⅡ，德國 Bruker 公司)，DataAnanlsis 工作站;Gradient A10 Mill-Q 超純水器(法國 Millipore 公司);冷凍離心機(Sigma,德國);微量分析天平(Mettler Toledo AL204 瑞士);渦旋混勻器(HYQ 2121A)

藥材與試劑 生首烏(批號：10050904)購于北京綠野藥業有限公司，經解放軍第三〇二醫院肖小河研究員鑒定為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb.)的干燥塊根;制何首烏(批號：10122402)有上述同一批生首烏炮制而成，炮制方法參照《中華人民共和國藥典(2010年版)》及《北京市中藥材炮制規范》，由北京綠野藥業有限公司協助完成。甲醇(色譜級，德國Merck公司)、去離子水經(18.2 MΩ) Millipore Milli-Q 系統(Millipore Co.，美國) 超純水器凈化，其他試劑為市售分析純。

動物與分組 SD大鼠，SPF級，體重160 g左右，雄性，共36只，購于軍事醫學科學院實驗動物中心(合格證號SCXK-軍2007-004)。動物飼養于屏障動物房，室溫(20±2)℃, 相對濕度60%～70%, 通風良好、環境安靜, 室內保持12小時照明, 12小時黑暗, 并定期消毒。將實驗動物SD大鼠隨機分為3組，正常對照組、生首烏醇提物組和制首烏醇提物組，每組12只。給藥劑量均為20 g生藥/kg，按4 mL/200 g體重灌胃給藥，正常對照組給予相同量蒸餾水，連續給藥28天。給藥期間動物自由飲食。最后一天取各組大鼠尿液，分裝保存在-80℃冰箱中。

藥品制備 本實驗醇提物所采用的提取方法為：將生首烏和制首烏分別粉碎得粗粉，加6倍量的75%乙醇冷浸提取，共提取5次，每次48小時，最后合并醇浸提取液，濃縮并減壓干燥，制得干粉備用。每次給藥前按生藥量折算配制藥液，水浴加熱至37 ℃時使用。

樣品制備與處理 大鼠尿液于-80℃冰箱中取出，復融，取250μL加入到1.5mL EP管中，再加入750μL的甲醇溶液，混勻，靜置，4 ℃冷凍離心(10,000 r/pm, 10 min)，取上清，于0.22μm微孔濾膜進行濾過，備用。

LC-MS條件 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，2.1*150mm);流動相：A：CH3OH，B：H2O;流速：0.25 mL·min-1;進樣量：20 μL;柱溫：25℃;樣品溫度：4℃;檢測波長：420nm;色譜梯度洗脫條件如表1。

質譜條件 離子源：ESI±;毛細管電壓：3500V; 質量數：50道爾頓到1000道爾頓;碰撞能：7 eV;錐孔能：5 eV;脫溶劑氣流量：6.0 L/min;脫溶劑氣溫度：180℃。

數據處理 采用德國布魯克公司Bruker Daltonics工作站中自帶的DataAnalysis和Mzmine軟件進行色譜峰識別，再將數據導入SIMCA-P-11軟件，標準化后進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判別(PLS-DA)分析。運用variable influence in the projection ( VIP)方法來預測各個代謝物對模型的貢獻值，VIP>1說明具有明顯的貢獻，有統計學意義，為可能的潛在標志物，再采用one-way ANOVA的方法，根據P<0.05的原則，排除沒有顯著性差異的數據。通過這一系列步驟之后，將剩下的有意義的數據在Human Metabolome Database、KEEG數據庫中進行匹配，并用標準品進行定位后，最終得到潛在的生物標志物。

結果

LC-MS色譜圖 平行測定何首烏大鼠尿液與正常對照組大鼠尿液，得到LC-MS色譜圖，如圖1所示。何首烏組和正常組大鼠在第一主成分上實現了完全分離，組內樣品較聚集，兩組大鼠的尿液代謝物譜信息存在顯著差異。

(A: 生何首烏給藥組，B: 制何首烏給藥組, C: 正常對照組)

PCA與PLS-DA結果 首先對何首烏致肝損傷組和正常組進行了無監督模式的PCA，其得分如圖2所示。結果顯示何首烏致肝損傷組與正常組可以獲得較好的分離，表明大鼠給予何首烏造成肝損傷后，生理代謝環境受到明顯干擾，病理狀態下代謝網絡出現紊亂。為了區別更多的離子峰，又分別對生首烏和制首烏致肝損傷大鼠尿液與正常組尿液進行了PLS-DA分析，其得分矩陣投影圖如圖3、圖4所示，可見何首烏致肝損傷組與正常組明顯區分開來。在建立PLS-DA模型基礎上，通過變量權重VIP值、載荷權重(loading weight)和相關系數(correlation cofficients)等多維統計分析指標篩選何首烏組與正常對照組之間的差異性變量。如圖3B、4B所示，圖中標紅色方框的點遠離原點，這些點所代表的化合物即為潛在的生物標志物。在線檢索一些數據庫，最終共篩選得到27個潛在的生物標志物，包括泛硫乙胺(Pantetheine)、Methyl bisnorbiotinyl ketone 、羥基皮質甾酮(18-Hydroxycorticosterone)、脫氧核糖磷酸(Deoxyribose 1-phosphate)和磷酸酰基甘油酮(Dihydroxyacetone Phosphate Acyl Ester)等，詳見表2。

C D

圖4 正常組與制首烏組大鼠尿液的PLS-DA 示意圖

(A：scores 圖;B：loading 載荷權重;C：VIP變量權重;D：相關系數)

表2 篩選出的潛在的生物標志物

討論

篩選出的27個潛在的生物標志物大致可分為磷脂類、氨基酸類、磷酸類、核苷酸類、多糖類、代謝相關中間物質等。

磷脂(Phospholipid)，也稱磷脂類、磷脂質，是含有磷酸的脂類，屬于復合脂。磷脂組成生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類，分別由甘油和鞘氨醇構成。人體所有細胞中都含有磷脂，它是維持生命活動的基礎物質。磷脂對活化細胞，維持新陳代謝，基礎代謝及荷爾蒙的均衡分泌，增強人體的免疫力和再生力，都能發揮重大的作用。如其中的磷酸酰基甘油酮[12](Dihydroxyacetone Phosphate Acyl Ester)是在甘油磷脂和脂質代謝通路中發現，其含量水平的異常表明體內脂質代謝通路紊亂。脂質的代謝包括脂類在小腸內消化、吸收，由淋巴系統進入血循環(通過脂蛋白轉運),經肝臟轉化，儲存于脂肪組織，需要時被組織利用。

氨基酸(Amino acid)是構成蛋白質(protein)的基本單位，賦予蛋白質特定的分子結構形態，使它的分子具有生化活性。蛋白質是生物體內重要的活性分子，包括催化新陳代謝的酶。L-β-天冬氨酰基-L-亮氨酸(L-beta-aspartyl-L-leucine)、羥基脯氨酰基半胱氨酸(Hydroxyprolyl-Cysteine)、酰基甘氨酸(Suberylglycine)都是蛋白質代謝的分解產物。

尿液中本身含有磷酸類物質。本實驗中篩選出的脫氧核糖磷酸[13](Deoxyribose 1-phosphate)是磷酸戊糖途徑代謝通路的代謝物，其含量水平異常表明磷酸戊糖代謝途徑發生紊亂，而磷酸戊糖途徑是指機體某些組織(如肝、脂肪組織等)以6-磷酸葡萄糖為起始物在6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸進而代謝生成磷酸戊糖為中間代謝物的過程。

核苷酸類化合物參與了生物體內幾乎所有的生物化學反應過程。核苷酸是核糖核酸及脫氧核糖核酸的基本組成單位，是體內合成核酸的前身物。核苷酸隨著核酸分布于生物體內各器官、組織、細胞的核及胞質中，并作為核酸的組成成分參與生物的遺傳、發育、生長等基本生命活動。甘氨酰胺核苷酸(Glycineamideribotide)是嘌呤核苷酸從頭合成過程中的中間產物，通過激活葡萄糖-6-磷酸-脫氫酶，刺激促黃體激素(LH)和絨毛膜促性腺激素(HCG)而形成。

透明質酸(Hyaluronic acid)基本結構是由兩個雙糖單位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的大型多糖類。透明質酸本身帶有負電荷，在動物體存在于大部分的軟結締組織中。它的水溶液為粘彈性流體，填充在細胞與膠原纖維空間之中且覆蓋在某些表皮組織上。在動物體，其主要功能乃保護及潤滑細胞，調節細胞在此粘彈性基質上的移動，穩定膠原網狀結構及保護它免于受到機械性的破壞。

代謝是生物體內所發生的用于維持生命的一系列有序的化學反應的總稱。這些反應進程使得生物體能夠生長和繁殖、保持它們的結構以及對外界環境做出反應。泛硫乙胺(Pantetheine)是體內輔酶A代謝的中間體，其含量的異常改變會影響哺乳動物肝臟中輔酶A 的中間代謝通路[14] 。2-六異戊二烯基-6-甲氧基-1,4-苯醌(2-Hexaprenyl-6-methoxy-1,4-benzoquinone)存在于泛醌生物合成途徑，泛醌最先由R.A.Morton從鼠肝脂質中分離出來的，在人體主要存在于肝、心、腎、腎上腺等組織。它在體內呼吸鏈中質子移位及電子傳遞中起重要作用，是細胞呼吸和細胞代謝的激活劑，也是重要的抗氧化劑和非特異性免疫增強劑。羥基皮質甾酮[15](18-Hydroxycorticosterone)與類固醇的生物合成代謝密切相關，類固醇代謝的異常可間接影響到體內膽汁酸和膽汁醇的變化，這也是某些肝臟疾病或膽道淤積病變的微觀體現。

總之，本研究應用代謝組學方法對何首烏致肝損傷大鼠尿液與正常大鼠尿液中的差異代謝物進行研究，經比較分析，共得到27個差異代謝物，這些重要的差異代謝物主要參與了機體內三羧酸循環、脂質代謝等相關通路。本研究為闡明何首烏致肝損傷的復雜機制提供了參考，也為何首烏致肝損傷的早期診斷與治療提供了思路。

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作者簡介：覃魯珊 女 碩士研究生 專業：中藥學

通訊作者：王伽伯，男，助理研究員，從事中藥藥性與毒性研究。E-mail: wjb0128@126.com , Tel/Fax:010-66933325。肖小河，男，研究員，博士生導師，從事臨床中藥學與合理用藥研究。E-mail: pharmacy302@126.com , Tel:010-66933322, Fax:010-66933325。