趙鐵a，張浩軍b，張相林a，趙婷婷b，藍輝耀c，羅國安d，李平b*

(a. 中日友好醫院 藥學部，北京 100029;

b. 中日友好醫院 臨床醫學研究所藥物藥理室，北京 100029;

c. 香港中文大學李嘉誠健康研究所&醫療系;d. 清華大學生物有機磷化學&化學生物學教育部重點實驗室)

[第一作者]趙鐵，主管藥師，從事代謝組學和中藥有效組分研究，Tel：010-84205248，E-mail：tiezhao@qq.com

[通訊作者]*李平，教授，從事慢性腎臟病中藥藥理研究，Tel：010-84205633，E-mail：" lp8675@yahoo.com.cn

[摘要] 目的：研究柴黃益腎顆粒干預對糖尿病腎病(DN)大鼠腎臟異常代謝物的調節作用。 方法：采用單側腎切除加i.p.鏈脲佐菌素誘導的方法復制DN大鼠模型，將48只Wistar大鼠分成5組，包括空白組、模型組、模型+柴黃益腎顆粒組、模型+福辛普利組、空白+柴黃益腎顆粒組。大鼠分別灌胃給予柴黃益腎顆粒和福辛普利，于第20周，采集腎皮質樣品進行基于液質聯用的代謝組學和脂質組學研究，考察干預前后代謝物譜的變化。 結果：柴黃益腎顆粒干預能夠顯著回調DN大鼠腎皮質中升高的有機毒素分子，包括尿毒素和葡糖糖苷酸物質，以及降低的鞘脂代謝物。 結論：柴黃益腎顆粒干預可以延緩大鼠DN的進展，該機制可能與其對有機毒素和鞘脂代謝異常的調節有關。

[關鍵詞] 糖尿病腎病;柴黃益腎顆粒;代謝組學;脂質組學;超高壓液相-四級桿飛行時間質譜聯用儀

Intrarenal Metabolomic Study of the Protective Effect of

Chaihuang-Yishen Granule on Rats With Diabetic Nephropathy

Tie Zhaoa, Haojun Zhangb, Xianglin Zhang a, Tingting Zhaob, Huiyao Lanc ,Guoan Luod, Ping Lib

aDepartment of Pharmacy, China-Japan Friendship Hospital, Beijing, China. bDepartment of Pharmacology, Institute of Clinical Medical Sciences, China-Japan Friendship Hospital, Beijing, China. cDepartment of Medicine and Therapeutics, and Li Ka Shing Institute of Health Sciences, the Chinese University of Hong Kong, Hong Kong SAR, China. dKey Laboratory of Bioorganic Phosphorus Chemistry & Chemical Biology (Ministry of Education), Department of Chemistry, Tsinghua University, China,

[Abstract] Objective: To study the protective effect of Chaihuang-Yishen granules on dysregulated metabolism in kidney of rats with DN. Method: Wistar rats were undergone uninephrectomy and a single intraperitoneal injection of streptozocin to induce diabetes, and administratered with chaihuang-Yishen granules and fosinopril. At the end of 20 weeks, renal cortex of rats were removed and used to UPLC-QTOF MS based metabolomic and lipidomic study, investigating the alterations of globally abnormal metabolome after administration of Chaihuang Yishen granules. Result: Chaihuang-Yishen granules can significantly normalize the elevated organic toxins including uremic toxins and glucuronides, and declined sphingomyelins. Conlusion: Chaihuang-Yishen gruanules can retard the development of DN in rats, which might be associated with its regulation in abnormally expressed metabolites, especially organic toxins and sphingomyelins.

[Key words] diabetic nephropathy; Chaihuang-Yishen granules; metabolomics; lipidomics; UPLC-QTOF MS

糖尿病腎病(Diabtetic Nephropathy, DN)是糖尿病最嚴重的微血管并發癥之一，也是終末期腎病的一個主要原因[1-3]。將近1/3的1型糖尿病患者和大約25%的2型糖尿病患者會發展成糖尿病腎病[4]。糖尿病腎病是一種復雜的慢性代謝性疾病[5]。盡管高血糖是公認的DN發生的先決條件，并且近些年學者們也提出了許多關于糖尿病腎病發病機制的假說[6]，但DN的深層次的發生發展的機理至今仍不清楚。中醫藥在治療慢性腎臟病方面具有獨特的優勢和特色[3, 7]。我室李平主任結合時振聲教授的臨證經驗和前期的研究成果研制出了由柴胡、黃芪等7味中藥組成的柴黃益腎顆粒。長期的臨床觀察證明：該方對慢性腎炎蛋白尿具有明顯的治療作用，特別是對一些難治性腎臟病，療效尤為顯著。作者也進行了柴黃益腎顆粒保護DN的藥效學的預試驗研究，結果表明，柴黃益腎顆粒能夠有效地延緩DN的進展，但其作用機制還有待研究。

以整體代謝指紋或輪廓分析為特點的代謝組學在DM等代謝性疾病研究領域里逐漸引起重視[8-10]。目前許多研究組已經開展了DN的代謝組學研究[11-13]，他們中大多是基于臨床或動物的血尿樣本的研究。糖尿病腎病，作為一種受累器官明確的繼發性疾病來說，針對腎臟皮質組織的代謝組學研究將比血液尿液的代謝組學研究更具有特異性。

脂類物質是組成生物體的基本物質之一，在生物體內復雜的生理反應過程中扮演著十分重要的角色。近年來，已有許多研究者通過脂質組學的研究發現，許多異常的生理狀態都與脂代謝紊亂相關，例如糖尿病、肥胖癥、動脈粥樣硬化、冠心病以及腦損傷等[14-15]。

在以前的研究中，為了能夠更深入的了解DN發病的機制，我們分別利用代謝組學[16]和脂質組學[17]分析技術，以STZ誘導的DN大鼠為模型，分析了腎皮質中與DN相關的異常代謝物和脂質成分，探討了其在DN發展過程中的作用。本研究中，我們將在此前研究的基礎上，應用整合代謝和脂質組學平臺，進一步探討柴黃益腎顆粒及其對照藥福辛普利的相關作用機制，為復方中藥防治DN提供科學依據。

1 材料

1.1 藥物及試劑 柴黃益腎顆粒由黃芪(503 g)、當歸(252 g)、柴胡(252 g)、穿山龍(377 g)、石韋(302 g)、豬苓(302 g)和水蛭(76 g)7味中藥組成。取黃芪、石韋、豬苓、水蛭加12倍水煎煮3次，每次1.5 h，合并煎液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.28~1.30的稠膏。當歸、穿山龍、柴胡加5倍量60%乙醇浸漬提取3次，每次浸泡3 d，合并3次提取液，減壓濃縮得相對密度為1.28~1.30 的稠膏。合并兩部分稠膏，混勻，真空干燥，粉碎，過60目篩得干粉，加糊精約1.4倍到1 000 g，混勻，加75%乙醇適量制粒，干燥，分裝(每袋8 g)，即得。成品質量控制要求含薯蕷皂苷(C45H72O16)不得少于2.50 mg.g-1。以蒸餾水按0.56 g.kg-1的給藥劑量配制成溶液，4 ℃保存，有效期6 d，灌胃給藥前取出放置至室溫。血糖試紙(強生公司)，考馬斯亮藍G250(Sigma公司)，水合氯醛(北京化學試劑公司，分析純)，甲醛溶液(國藥集團化學試劑有限公司，分析純)，肌酐試劑盒(北京北化康泰臨床試劑公司)，鏈脲佐菌素(美國Sigma公司)，提取溶劑甲醇、氯仿(德國Merck公司)均為等度色譜純，流動相溶劑乙腈、異丙醇(德國Merck公司)均為梯度色譜純，2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT，美國，Sigma公司)。總蛋白(TP)試劑盒(批號09-0622)、白蛋白(ALB)試劑盒(批號09-0921)和血尿素氮(BUN)試劑盒(批號09-09279)購于G-Cell公司，血肌酐(Scr)試劑盒(批號:61773401)購于羅氏公司，血清總膽固醇(TC)試劑盒(批號20091001)、甘油三酯(TG)試劑盒(批號20091101)購于申索公司。

1.2 儀器 CD-1600全自動生化分析儀(雅培公司)，One Touch Ultra II穩豪二代血糖儀(強生公司)，BX-51顯微鏡(奧林巴斯公司)，組織勻漿機T10 basic(IKA, Staufen, Germany)，離心濃縮儀(太倉市科教儀器廠)，超高壓液相色譜(Acquity，美國沃特世科技有限公司)，四級桿飛行時間質譜聯用儀(Xevo G2，美國沃特世科技有限公司)，液相色譜柱(BEH, 1 mm×50 mm, 1.7 μm，美國沃特世科技有限公司)，高效液相色譜儀：Agilent 1100 Series。

2方法

2.1 動物模型及實驗設計

Wistar大鼠48只，SPF級，雄性，8周齡，體重180～220 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK(京) 2007-0001。飼養于中日友好醫院動物室屏障系統，許可證號SYXK(京) 2005-0019。實驗期間，大鼠給予普通飼料(中國醫學科學院實驗動物研究所提供)，自由飲水、進食。整個實驗過程，全部動物的飼養條件為溫度20～25 ˚C，濕度65%～69%，12 h光照/黑暗循環，期間自由進食和飲水。

動物購入后適應性喂養1周，進行基礎狀態測定，剔除血糖與尿蛋白異常的動物，其余動物先按體重隨機進行手術和假手術處理。

假手術：大鼠以3.3 mL·kg-1腹腔注射10%水合氯醛麻醉，背部進行術前備皮，常規消毒，背部切口1~1.5 cm，充分暴露右腎，剝離腎臟脂肪包膜，縫合切口。術后1周以4 mL·kg-1的劑量腹腔注射0.1 mmol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

手術：大鼠麻醉、備皮及消毒處理同假手術組，背部切口1~1.5 cm，暴露右腎，剝離腎臟脂肪及腎上腺，結扎右腎門血管，切除右腎[18]，縫合切口。術后動物恢復1周后，按40 mg·kg-1腹腔注射1%的鏈脲佐菌素，72 h后尾尖采血測血糖，以血糖高于16.7 mmol·L-1做為模型成功標準。

假手術動物按體重和血糖隨機分為空白組和空白+柴黃益腎顆粒組，手術造模成功動物按體重和血糖隨機分為模型組和模型+柴黃益腎顆粒組，具體分組與給藥方案如下：

空白組(C)：假手術+檸檬酸緩沖液+等容積蒸餾水(n=11)

模型組(M)：單側腎切除+Stz注射+等容積蒸餾水(n=10)

模型+柴黃益腎顆粒組(CH)：單側腎切除+Stz注射+柴黃益腎顆粒組(0.56 g·kg-1,相當于臨床劑量5倍)(n=12)

模型+福辛普利組(F)：單側腎切除+Stz注射+福辛普利(1.67mg/kg)(相當于臨床劑量5倍)(n=11)

空白+柴黃益腎顆粒組(CHC)：假手術+檸檬酸緩沖液+柴黃益腎顆粒(1.12 g·kg-1)(n=5)

各組大鼠分籠飼養，自由飲食進水，給藥方式為ig給藥，每日1次，于上午進行，連續給藥20周。

造模后第0，4，8，12，16，20周，大鼠尾尖采血測血糖，同時將大鼠轉入代謝籠內，禁食不禁水，收集24 h尿液。于20周末禁食不禁水12 h，以3.3 mL·kg-1的劑量ip 10%的水合氯醛麻醉動物，眼眶后靜脈叢取血，離心后取血清;大鼠在經過在體心臟灌流后，立即取出左腎，剝離腎包膜，縱剖為兩片，取一片固定于10 %中性甲醛溶液以進行組織病理學檢查，另一片剪下腎皮質并分成兩份，一份40mg，一份60mg，精密稱重，置于2mL離心管中，置超低溫冰箱中保存，待用。

2.2 指標檢測及病理分析

2.2.1 一般狀態 動物每周稱體重，密切觀察動物精神狀態，反應性，毛發色澤，飲食及排泄狀況。

2.2.2血生化指標 用血糖儀測定各時間點血糖值，取血清，用全自動血生化分析儀測定血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)。

2.2.3 尿蛋白 將各時間點收集的尿液以3 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，用考馬斯亮藍法檢測尿蛋白濃度。

2.2.4 組織病理學指標[19] 腎組織經10%福爾馬林固定24 h后，常規脫水，透明，石蠟包埋，經切片機分別切為3 µm厚切片，進行PAS染色，光鏡下觀察腎組織病理學變化。

2.3 代謝組學分析[16]

為減少儀器帶來的系統誤差，我們全部的分析都按照“對照組-模型組-柴黃組-福辛普利組-中藥對照組-福辛普利組-柴黃組-模型組-對照組”的順序交叉測定，并在分析全過程中設置質控(QC)樣品，監控分析結果的質量，必要時可適當用于數據的校正。

我們利用整合GC-tofMS和LCtofMS平臺進行腎皮質代謝組學分析，兩分析儀器公用一部分相同的樣品前處理方法：新鮮的腎皮質組織(60mg)從超低溫冰箱中取出，立即加入800uL甲醇和20uL二元內標混合溶液(L-2-chlorophenylalanine and heptadecanoic acid at concentration level 0.5 mg/mL)，在冰浴上勻漿2次，每次30秒。所得勻漿液被儲存在4℃冰箱中過夜，然后在4°C下以12000轉/分的速度離心10分鐘，所得上清液等分成兩份，每份300uL，分別用于LC-tofMS和GCtofMS分析。

GCtofMS分析

將300uL上清液轉移到帶有內插管的樣品瓶中，在真空離心濃縮干燥儀上濃縮至干，然后進行三甲基硅烷(TMS)衍生化。衍生化步驟與以前的報道[20]類似，略有調整。簡要的說，將50-µL 甲氧胺(15 mg/mL溶解在吡啶中) 溶液加入干燥的樣品中，渦旋振蕩30秒，然后置于搖床中恒溫30°C，肟化羰基，90分鐘后取出，加入50 µL BSTFA (containing 1% TMCS)，渦旋振蕩30秒，靜置于70°C鼓風干燥箱中硅烷化反應1小時。

衍生化后的樣品以不分流模式注入到GCtofMS中進行分析，進樣量為1µL, 色譜柱為DB-5 毛細管柱(30 m × 250 µm i.d., 0.25-µm film thickness)，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min。進樣溫度設定為270°C。柱溫梯度為80°C 維持2分鐘，然后以10°C/分鐘程序升溫至180°C，5°C/分鐘升至240°C，25°C /分鐘至290°C，維持9分鐘，然后回到起始溫度。傳遞線(Transfer line)溫度和離子源溫度分別為260°C和200°C。質譜采用電子轟擊源(70ev)及全掃描模式，掃描范圍為m/z 30-600。

UPLCtofMS分析

將另300ul上清液轉移至高回收樣品瓶中，進行UPLCtofMS分析。色譜柱為反相C18 柱(10 cm×2.1mm, 1.7μm),柱溫恒定為50℃，流動相梯度為5–50% B(0-3 min),50-70% B( 3-10min) 70-100% B(10-15 min), 100%B保持5min，這里A=水(0.1% ammonium formate)，B=乙腈。流速為0.4 mL/min，進樣量：2ul(ESI+)，4ul(ESI-).樣品按照正常-模型-柴黃益腎顆粒-福辛普利-正常對照的順序分析。樣本室溫度為4℃。

質譜數據的采集在Micromass 飛行時間質譜(LCT Premier XE)上進行。掃描范圍為50 to 600 m/z，掃描時間0.2秒，掃描間隔時間0.05秒，整個分析時長28分鐘。源溫為120℃，錐孔氣流50 L/h，脫溶劑氣流600 L/h，脫溶劑氣體溫度350℃。 毛細管和錐孔電壓分別為2.3kV和40V。質譜操作在W optics mode下，分辨率為12,000，開啟動態范圍擴展功能(DRE)。亮氨酸腦啡肽(Leucine enkephalin)作為 lock mass ，濃度為2μg/mL ，流速為20μL/min, lockspray frequency為10秒。 系統工作站為MassLynx software (Waters)，用于儀器控制和數據采集。

2.4 脂質組學分析[17, 21] 從超低溫冰箱或液氮中取出裝有40 mg腎皮質的離心管，立即加5元內標30 µL，再加入提取溶劑(甲醇/氯仿=2：1，含0.01 %BHT)700 µL，最高檔勻漿30 s，停2 min，如此反復2次。靜置30 min后，加入550 µL氯仿和350 µL生理鹽水(0.9 % NaCl)，渦旋30 s，10 000 r·min-1離心5 min，盡可能多的吸取下層清液，置于離心管中，分取550 µL和50 µL置于兩樣品瓶中，離心濃縮至干后加50 µL甲醇/氯仿(1:1)混合溶劑，渦旋 30 s復溶，再加入200 µL甲醇稀釋，分別進行正負離子模式的脂質指紋譜分析。

流動相A為含1%甲酸銨(1M)的乙腈/異丙醇(5/2)，B為1%甲酸銨。A從35%線性升高到65%(0~3 min)，維持1 min，然后線性升高到95%(4~6 min)，再逐漸升高到100%(6~9 min)，維持3 min后，逐漸回到起始梯度，整個分析過程共計17 min，柱溫50 ℃，流速恒定為0.2 mL·min-1，進樣量為1 µL。

質譜采用電噴霧離子化模式，源溫為120°C，脫溶劑氣流速和溫度分別為600 L·h-1和350 °C，質量掃描范圍400~1 000 amu，正離子模式(ES+)和負離子模式(ES-)的毛細管電壓分別為3.0和2.5 kV。Lockspray mass是2 mg·L-1的亮氨酸腦啡肽溶液。

分析過程按照“空白組-模型組-模型+柴黃益腎顆粒組-空白+柴黃益腎顆粒組”的順序交叉測定，并在全過程中設置質控(QC)樣品。

2.5 數據處理及統計分析

2.5.1代謝組數據處理及結構鑒定

GCtofMS數據

將GCtofMS分析所得的質譜數據由ChromaTOF工作站軟件以NetCDF格式導出。這些CDF文件用Matlab 7.0工具箱中hierarchical multivariate curve resolution (H-MCR)修改的用戶自定義程序[22-23]進行數據前處理提取特征變量，包括基線矯正、去噪、平滑、對齊，時間-窗口分裂，多元曲線分離(基于多元曲線分離算法)等。所得三維數據集包括樣品信息、峰保留時間和峰強度。數據集中內標和由噪音，柱流失及BSTFA衍生化引起的人造峰須先被除去。葡萄糖的相關峰在數據歸一化前也要去掉。歸一化是將每個峰的強度除以一個樣品全部峰強度的總和。

所得數據集導入SIMCA-p 11.5 軟件進行多元統計分析。數據首先經過中心化和Parto處理，然后進行主成分分析(PCA)或偏最小二乘判別分析(PLSDA)。PCA是一種非監督的模式識別方法，可以用來判斷多維數據集的一般聚類情況。PLS-DA是一種有監督的模式識別方法，一般用來建立組間的預測模型，判別多維變量在組間是否存在明顯的差異。在本研究中，我們應用軟件中默認的7輪交互驗證方法以防止模式的過度擬合。我們應用獨立T檢驗來比較組間均值是否存在顯著差異，正常vs模型顯著性差異的標準設為p<0.01，而柴黃益腎顆粒和福辛普利治療前后的顯著性差異標準為p<0.05。我們計算了每個差異變量相應的倍數變化，以顯示它們在模型組以及治療前后的變化程度。

代謝物鑒定是通過用NIST MS search 2.0軟件比較質譜碎片與NIST 08標準質譜庫(相似度超過70%)并最終用標準品驗證的。

UPLCtofMS數據

UPLCtofMS ES+和ES-分析獲得的原始數據由MarkerLynx Applications Manager version 4.1 進行提取。MarkerLynx的參數設定為：

每個測到的峰強度形成列表，由保留時間和m/z組成的數據對作為該離子的指征。所得三維矩陣包括峰指征(保留時間-m/z對)，樣品名稱和離子強度。為了排除噪音的干擾，所得數據按照30%原則進一步去除缺失值(離子強度=0)在正常和模型樣本中超過30%的變量。內標峰同樣也要被去掉。

所得數據像GCtofMS數據一樣經歸一化并導入SIMCA-p 11.5進行多元統計分析。除了獨立T檢驗(臨界p-value設定與GCtofMS數據相似)，由PLSDA模型計算得到的變量重要性參數(VIP)也被用來判斷變量對模型組與正常組之間的差異是否具有顯著貢獻，其最小臨界值設為1。只有同時滿足VIP>1和p<0.01(T檢驗)的變量，才確定為模型組與對照組間的差異變量。

代謝物鑒定是通過與自建的標準品庫及其他網絡數據庫(如HMDB，pubchem, metlin and lipidmaps等)比較質譜獲得的精確質量數與和保留時間來推斷的。

2.5.2脂質組學數據處理及結構鑒定[16]

UPLCMS數據

數據提取方式與UPLC-tofMS部分描述的相似，但由于UPLC-MS為只有單位質量數的分辨率，因此MarkerLynx的參數設定略有區別，而且脂質的鑒定除結合LCtofMS分析提供的各個峰的精確質量數外，必須結合正負離子模式、源內CID提供的特征碎片等信息并對照互聯網上的一些專業數據庫，比如HMDB, Lipidmaps, pubchem和metlin等，進行檢索判斷。

MSMS數據

MSMS數據的提取由Masslynx工作站軟件自行讀取。所得數據僅采用獨立T檢驗進行統計分析。

2.6其它數據分析 血生化指標、尿蛋白等常規指標組間比較采用獨立T檢驗法，在EXCEL2003中完成。數據以平均值±SD形式表示，P<0.05有統計學意義。

3.結果

3.1 傳統指標及腎組織病理的改變 代表性PAS及體重、血糖、24小時尿蛋白、血生化等參數在空白、模型和福辛普利及柴黃益腎顆粒組的變化已在以前的研究結果中提及[16-17]。簡單地說，福辛普利治療可以顯著降低模型組動物的甘油三酯、膽固醇和24小時尿蛋白水平，升高其血清白蛋白水平，但對血糖、總蛋白、血尿素氮、體重和腎重指數無顯著影響。柴黃益腎顆粒治療可以顯著降低模型動物的24小時尿蛋白水平，對甘油三酯和膽固醇亦有降低趨勢(p=0.08和0.06)。各組間血肌酐水平無統計學差異。中藥+對照組各指標與假手術組無顯著差異(數據未顯示)。柴黃益腎顆粒和福辛普利治療均能顯著減輕腎小球和小管結構的改變。中藥干預對假手術組的腎組織病理無顯著影響(數據未顯示)。

3.2 總體樣本整體代謝表達譜的偏最小二乘判別分析

GCtofMS代謝指紋譜分析得到的色譜圖，通過數據讀取軟件，轉換成三維矩陣(樣品×變量×強度)。經過數據處理和鑒定等工作，我們提取到了超過600個特征變量(用保留時間(retention time)和質荷比(m/z)表示)，通過自建標準品庫(Sigma–Aldrich, USA)及商業化合物數據庫(NIST、NBS、Wiley等)鑒定了其中的120個代謝物。為了使組間的整體代謝差異可視化，我們對全部樣品的數據進行了PLSDA判別分析。葡萄糖是糖尿病的重要生化指標，且濃度很高，必然對模型分組產生明顯影響。為了減少葡萄糖的影響，使判別模型更好的反映非葡萄糖代謝物的貢獻，我們從數據中去除了幾個鑒定為葡萄糖的變量，然后再進行后續的數據分析。在去除了內標對應的幾個變量后，我們將歸一化處理的數據導入Simca-P 11.5 (Umetrics, Umeå, Sweden)，進行多維統計分析。數據經中心化 和Parto前處理后，我們利用Simca-P成功建立PLSDA模型。建好的PLSDA模型的得分圖顯示在圖1(A)中。如圖所示，模型組和空白組在一維上即得到完全分離，這表明DN大鼠腎皮質的基于GCtofMS的整體代謝表達譜與空白組有顯著差異。空白+中藥組與空白組沒有明顯分離，因此表明中藥本身未對代謝表達譜(基于GCtofMS)產生明顯的影響。而柴黃益腎顆粒和福辛普利治療組與模型組比較均沒有明顯分離，僅表現出一定的向空白組回歸的趨勢，柴黃益腎顆粒治療相對于福辛普利來說這種趨勢更明顯一些，這表明DN相關的代謝異常可能被柴黃益腎顆粒和福辛普利治療改善，而柴黃益腎顆粒的這種改善效果較福辛普利更明顯。

類似地，對于LCtofMS分析得到的代謝指紋色譜圖，我們用Markerlynx將其轉化為三維數據矩陣(樣品, 變量和峰高)。如果某個變量在模型組和對照組總樣品數中出現0的比例超過70%，則該變量被認為是噪音而剔除。數據在Simca-P 中構建PLSDA模型前，也經過內標扣除、歸一化及中心化、Parto前處理。ES-和ES+模式所得數據的PLSDA得分圖見圖1B和1C)。與GCtofMS的結果相比，我們可以觀察到類似的組間聚集情況。有區別的是，ES-的PLSDA結果顯示柴黃益腎顆粒和福辛普利治療均有較明顯的回調作用。而ES+的PLSDA結果則顯示福辛普利治療改善效果較明顯。

對于UPLC-TOFMS脂質組分析得到的指紋色譜圖，我們采用與基于UPLC-TOFMS的代謝指紋譜同樣的數據分析方法。ES- 和ES+模式所得數據的PLSDA得分圖見圖1D和1E。PLSDA結果表明，表明DN大鼠腎皮質的基于LCMS ES+/-的脂質表達譜較空白組有顯著差異，中藥本身也未對代謝表達譜(基于LCMS脂質組指紋譜)產生明顯影響。福辛普利和柴黃益腎顆粒治療組均明顯向空白組靠攏，提示兩者治療在一定程度上均能回調紊亂的脂質代謝狀態;但福辛普利治療組較柴黃益腎顆粒治療組更接近于空白組，提示對于脂質代謝物來說，福辛普利的改善效果較柴黃益腎顆粒更明顯。ES-與ES+模式的PLSDA得分圖比較，福辛普利治療組在ES+模式下更接近于對照組，并且已經于模型組明顯分離，這可能提示福辛普利比柴黃益腎顆粒更能改善一些諸如磷脂酰膽堿類的易于在ES+模式下電離的脂類代謝物。

圖1 總體樣本整體代謝表達譜的PLSDA

A, B, C依次為GCtofMS、UPLC-TOFMS ES- 和UPLC-TOFMS ES+分析所得代謝組數據的PLSDA結果;D, E分別為UPLC-TOFMS ES- 和UPLC-TOFMS ES+分析所得脂質組數據的PLSDA結果;其中，C-空白組;M-模型組;CH-柴黃益腎顆粒組;F-福辛普利組;CHC-空白+中藥組。

3.3 反映糖尿病腎病代謝表型的差異代謝物的鑒定

基于GCTOFMS和LCTOFMS的代謝指紋譜及基于LCMS的脂質指紋譜反映的DN差異代謝物的鑒定結果已另文發表[16-17]。基于MSMS的PA和PS代謝輪廓分析鑒定的DN差異脂質成分如表2所示。

除了一系列差異代謝物與DN進展有密切相關性[16]，部分差異脂質成分也表現了一定的相關性。表1中所列脂質與尿蛋白水平及小管間質損傷程度均為負相關，即伴隨著DM腎損傷的進展，腎皮質中的許多脂質(一些PC、PE、PI、PA、PS及SM等)表現出減少的趨勢。

3.4柴黃益腎顆粒干預對DN大鼠代謝表型的影響

以前述鑒定的差異代謝物作為評價藥物治療作用的指標，觀察柴黃益腎顆粒及其對照藥福辛普利對大鼠DN相關的異常代謝表達的影響。柴黃益腎治療組的DN相關差異代謝物水平分別與模型組進行獨立T檢驗。滿足 p<0.05且可鑒定的代謝物的結果列于表2中。結果顯示，柴黃益腎顆粒和福辛普利治療都對許多異常代謝表現出明顯的回調作用，總體來說，柴黃益腎顆粒對二(多)碳羧酸、羥酸、葡萄糖、尿毒素分子改善作用明顯，而福辛普利治療則對氨基酸、羥酸、非葡萄糖類糖、酰基肉毒堿及尿毒素分子回調明顯。兩者治療影響的差異代謝譜雖然不完全一樣，但對幾個重要的差異代謝物卻表現了相似的影響，比如馬尿酸, 2-Phenylethanol glucuronide, 2,8-Dihydroxyquinoline-beta-D-glucuronide /3-Indole carboxylic acid glucuronide(同分異構體), 6-Hydroxy-5-methoxyindole glucuronide/ 5-Hydroxy-6-methoxyindole glucuronide(同分異構體). 其它一些在兩種治療作用中表現相同回調趨勢的代謝物有：malic acid, 2-hydroxyacetic acid (Glycolic acid), 4-Hydroxybutyric acid, L-Threitol, methyl-πD-mannopyranoside，mannose. 一些代謝性差異代謝物在各組間的含量分布進一步以柱狀圖的形式表示(圖2)。

表 2 柴黃益腎顆粒和福辛普利治療影響的DN相關差異代謝物

aFd(CH/M)是儀器測得的柴黃益腎顆粒組和模型組的代謝物平均相對強度的比值，‘+ ’和‘- ’分別代表該代謝物在治療組中升高和降低。

bFd(F/M)是儀器測得的福辛普利組和模型組的代謝物平均相對強度的比值，‘+ ’和‘- ’分別代表該代謝物在治療組中升高和降低。

類似地，以差異脂質代謝物作為評價藥物治療作用的指標，觀察柴黃益腎顆粒及福辛普利對大鼠DN相關異常代謝表達的影響。柴黃益腎治療組及福辛普利治療組的DN相關差異脂質代謝物水平分別與模型組進行獨立T檢驗。滿足 p<0.05且可鑒定的脂質代謝物的結果列于表2中。結果顯示，柴黃益腎顆粒和福辛普利治療都對許多異常代謝表現出明顯的回調作用，總體來說，福辛普利比柴黃益腎顆粒能夠更有效地回調多種脂質代謝物，包括PC、PE、SM等。柴黃益腎顆粒雖然在改善PC、PE上明顯不如福辛普利，但其對SM、PA和PS的改善作用與福辛普利相差不大。一些代表性差異代謝物在各組間的含量分布進一步以柱狀圖的形式表示(圖2)。

圖2 能夠被柴黃益腎顆粒或福辛普利治療回調的代謝物相對強度分布柱狀圖

C-空白組;M-模型組;CH-柴黃益腎顆粒組;F-福辛普利組;CHC-空白+中藥組。數據以平均值±SD形式表示，*p<0.05, **p<0.01, vs模型組.

4.討論

腎皮質是腎臟的重要組成部分，因此皮質中一些小分子代謝物的異常很可能與糖尿病腎病的發生發展密切相關。本試驗被設計來尋找與糖尿病腎病相關的腎皮質中小分子代謝物的異常變化，探討糖尿病腎病的發病機理，并通過觀察柴黃益腎顆粒和福辛普利治療對異常代謝表達譜的影響，研究其治療DN的作用機理。為了擴大代謝視窗，我們在數據采集時創新性地應用了兩個子平臺(代謝組和脂質組)整合的平臺技術;為了減少血液對測定結果的影響，我們在組織取材時采用了活體灌流的方式。與空白組相比，DN組皮質中異常表達的代謝物，包括氨基酸、糖類、多元醇、溶血磷脂，有機毒素分子, 葡糖糖苷酸類、PC、PE、PS、PA、SM、TG及其它重要的但未能鑒定的代謝物等。柴黃益腎顆粒和福辛普利治療都可以延緩DN進展，可能與其對一些差異代謝物的調節有關。

4.1柴黃益腎顆粒對DN大鼠腎皮質尿毒素和葡萄糖苷酸代謝異常的調節作用

之前的研究中，我們發現腎皮質中尿毒素和葡萄糖苷酸代謝異常與大鼠DN進展具有顯著的相關性。本研究中，我們發現應用柴黃益腎顆粒和福辛普利干預可以使腎皮質多數有機離子水平明顯下降(其中包括尿毒素和未能鑒定的有機酸分子等)，同時蛋白尿和小管間質損傷有相應程度的緩解。我們推測調節有機毒素在腎臟中代謝或排泄影響相關的上下游途徑可能是柴黃益腎顆粒和福辛普利發揮對DN大鼠的腎保護作用的一種重要機制。Merlin C. Thomas[24-25] 報道ACEI可以通過上調OCT以及小管有機離子清除率延緩DN進展，可見ACEI對小管功能有一定的保護作用。因此，我們進一步推測可能是因為這種保護作用，降低了有機離子在小管中的積聚，從而降低了腎皮質中有機毒素離子的水平，進而緩解了小管間質損傷程度和降低了蛋白尿水平。ACEI的這種藥理機制可能為其延緩糖尿病腎病的非降壓依賴作用機制研究提供新的線索。而柴黃益腎顆粒可能也具有類似的藥理機制。柴黃益腎顆粒和福辛普利干預的結果，恰好從不同的角度進一步證明了這些能夠被回調的差異代謝物與DN進展之間的關系。但柴黃益腎顆粒和福辛普利都不能回調顯著升高的毒性物質吲哚磺酸，可能預示著不同的毒素在腎臟中有著不同的轉運機制，柴黃益腎顆粒和福辛普利治療不能影響到全部的機制，因而不能對全部毒素有效。

本研究對DN的臨床治療有一定的提示作用，應注意對DM或DN早期患者的腎小管功能進行保護，可能越早使用吸附劑或ACEI或柴黃益腎顆粒越能延緩DM進入DN。目前，已經有兩篇文獻提倡并通過臨床試驗證明對于DM患者吸附劑應盡可能早期干預[26-27]。

4.2柴黃益腎顆粒和福辛普利對脂質的調節作用

脂質代謝紊亂與DM發生發展的關系早已引起人們的關注[28]，但至今不能明確其是否影響DN的進展。近年來，已陸續有學者開展了實驗DM動物模型腎臟器官或組織水平上的脂質變化規律的研究。我們之前的研究表明，部分磷脂和鞘脂代謝異常與DN進展之間有顯著的相關性。柴黃益腎顆粒和福辛普利干預對脂質代謝異常均有一定的改善作用。兩者對PA和PS的影響都較小，對SM的影響都比較大(福辛普利略好于柴黃益腎顆粒)，而對其它脂類，尤其是PC、PE，福辛普利的調節能力明顯優于柴黃益腎顆粒。因此，針對鞘脂代謝通路相關酶的調節可能是柴黃益腎顆粒和福辛普利共同的作用機制。同時，福辛普利還可作用于調節磷脂尤其是PC和PE代謝通路相關的靶點。

4.3柴黃益腎顆粒和福辛普利作用機制的比較及總結

從生化指標、病理學結果及分子量在500amu以下的小分子代謝組分析結果看，柴黃益腎顆粒和福辛普利的治療效果無顯著差異，但從脂質組分析結果看，柴黃益腎顆粒對STZ誘導的DN大鼠腎皮質的脂質代謝異常的改善作用不如福辛普利。因此，總體來說，柴黃益腎顆粒雖然對DN有明顯的療效，但其對生理狀態的調節要略遜于福辛普利。

另一方面，試驗結果表明柴黃益腎顆粒和福辛普利改善的代謝譜存在明顯的交疊。這提示我們柴黃益腎顆粒(包括其它一些治療DN的中成藥)，可能與福辛普利有著某些共同的作用機制。比如，兩者均可調節異常腎皮質中升高的有機酸尿毒素分子，說明柴黃益腎顆粒可能與ACEI一樣，可能通過保護腎小管功能，減少毒素聚集，延緩DN的進展;兩者均可升高異常降低的SM，說明兩者可能均可通過改善鞘脂合成和代謝，發揮對腎臟的保護作用。根據本試驗的結果和討論，我們將柴黃益腎顆粒和福辛普利延緩DN進展可能的作用機制總結在圖3中。

圖3 柴黃益腎顆粒和福辛普利對DN大鼠保護作用的代謝相關機制總結

代表有變化的趨勢，但無統計學上的顯著性意義; 代表有統計學差異;

代表該途徑某一個代謝物異常，且有統計學差異，但有待設計相關實驗證明。

從整體代謝角度分析，柴黃益腎顆粒延緩DN進展可能與抑制腎皮質中積聚的有機毒素包括尿毒素和葡糖糖苷酸、調節鞘脂代謝紊亂以及下調過表達的GLUT1以及降低血脂等作用有關。福辛普利除與柴黃益腎顆粒同樣地影響有機毒素、鞘脂代謝紊亂和降低血脂外，還可能具有改善磷脂代謝紊亂和調節己糖胺代謝通路的作用。

5.結論

本研究將建立的基于GCtofMS、UPLCtofMS和UPLCMS的腎皮質整合代謝組學平臺被成功應用于柴黃益腎顆粒藥物作用機制的研究。發現一些與DN進展相關的異常代謝物可以被柴黃益腎顆粒或福辛普利有效改善，這可能是柴黃益腎顆粒及福辛普利延緩DN進展的一種重要機制。特別地，柴黃益腎顆粒干預能夠顯著回調升高的有機毒素分子(包括尿毒素和葡糖糖苷酸物質)以及降低的鞘脂代謝物，這可能為其藥理機制的研究提供新的線索。柴黃益腎顆粒和福辛普利對于DN的治療，存在某些共同的作用機制，如回調有機酸尿毒素和鞘脂類代謝物;但柴黃益腎顆粒對于脂質組代謝異常的調節要遜于福辛普利。

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